2010-××-××发布

2010-XX-XX实施

GB 4789.9-201X

中华人民共和国国家标准

食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验 National food safety standard Food micrbiological examination：Campylobacter jejuni

中华人民共和国卫生部   发布

 

食品安全国家标准

食品微生物学检验  空肠弯曲菌检验

1　范围

本标准规定了食品中空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）的检验方法。

本标准适用于食品中空肠弯曲菌的检验。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1  恒温培养箱：25 ℃±1 ℃，36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。

2.2  冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.3  恒温振荡培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。

2.4  天平：感量0.1 g。

2.5  均质器。

2.6  振荡器。

2.7  无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。

2.8  无菌锥形瓶：容量100 mL、200 mL、2 000 mL。

2.9  无菌培养皿：直径90 mm。

2.10  pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2.11  水浴装置：36 ℃±1 ℃，100 ℃。

2.12  微需氧培养装置：提供微需氧条件（5% 氧气、10% 二氧化碳和85% 氮气）。

2.13  过滤装置及滤膜（0.22 μm、0.45 μm）。

2.14  显微镜：10×～100×，有相差功能。

2.15  离心机：离心速度≥20000×g。

2.16  微生物生化鉴定系统。

3  培养基和试剂

3.1  Bolton 肉汤 (Bolton broth)：见附录A中A.1。

3.2  改良CCD琼脂(modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar, mCCDA)：见附录A中A.2。

3.3  空肠弯曲菌显色培养基。

3.4  哥伦比亚琼脂（Columbia blood agar）：见附录A中A.3。

3.5  布氏肉汤 (Brucella broth)：见附录A中A.4。

3.6  氧化酶检测试剂：见附录A中A.5

3.7  马尿酸钠水解检测试剂：见附录A中A.6。

3.8  Mueller Hinton琼脂(Mueller Hinton blood agar)：见附录A中A.7。

3.9  吲哚乙酸脂纸片：见附录A中A.8。

3.10 Skirrow琼脂（Skirrow agar）：见附录A中A.9。

3.11 0.1%蛋白胨水：见附录A中A.10。

3.12 2 mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液。

3.13 1mol / L硫代硫酸钠溶液。

3.14 3%过氧化氢溶液。

3.15 生化鉴定试剂盒。

3.16 生化鉴定卡。

4 检验程序

空肠弯曲菌检验程序见图1。

 

5 操作步骤

5.1样品处理

5.1.1  一般样品

取25 g（或25 mL) 样品（水果、蔬菜、水产品为50 g）加入盛有225 mL Bolton肉汤的有滤网的均质袋中（若为无滤网均质袋可使用无菌纱布过滤），用拍击式均质器均质1 min～2 min，经滤网或无菌纱布过滤，将滤过液进行培养。

5.1.2 整禽等样品

用200 mL 0.1%的蛋白胨水中充分冲洗样品的内外部，并振荡 2 min～3 min，经无菌纱布过滤至250 mL离心管中，16000×g离心15 min后弃去上清，用10 mL 0.1%蛋白胨水悬浮沉淀，吸取3 mL于100 mL Bolton肉汤中进行培养。

5.1.3  贝类

取至少12个带壳样品，除去外壳后将所有内容物放到均质袋中，用拍击式均质器均质1 min～2 min，取25ｇ样品至225 mL Bolton肉汤中（1:10稀释），充分震荡后再转移25 mL于225 mL Bolton肉汤中（1:100稀释），将1:10和1:100稀释的Bolton肉汤同时进行培养。

5.1.4  蛋黄液或蛋浆

取25 g （或25mL)样品于125 mL Bolton肉汤中并混匀（1:6稀释），再转移25 mL于100 mL Bolton肉汤中并混匀（1:30稀释），同时将1:6和1:30稀释的Bolton肉汤进行培养。

5.1.5 鲜乳、冰淇淋、奶酪等

若为液体乳制品称取50 g；或若为固体乳制品称取50 g加入盛有50 mL 0.1%蛋白胨水的有滤网均质袋中，用拍击式均质器均质15 s～30 s，保留滤过液。必要时调整pH值至7.5±0.2，将液体乳制品或滤过液以20000×g 离心30 min后弃去上清，用10 mL Bolton肉汤悬浮沉淀（尽量避免带入油层），再转移至90 mL Bolton肉汤进行培养。

5.1.6  需表面涂拭检测的样品           

无菌棉签擦拭检测样品的表面，将棉签头剪落到100 mL Bolton肉汤中进行培养。

5.1.7 水样

将4 L 的水（对于氯处理的水，在过滤前每升水中加入5 mL 1mol / L硫代硫酸钠溶液）经0.45 μm滤膜过滤，把滤膜浸没在100 mL Bolton肉汤中进行培养。

5.2  预增菌与增菌

在微需氧条件下，以100 r/min的振荡速度，36 ℃±1 ℃培养4 h。必要时测定增菌液的pH值并调整至7.4±0.2。42 ℃±1 ℃继续培养24 h～48 h。

5.3 分离

将24 h增菌液、48 h增菌液及对应的1:50稀释液分别划线接种于Skirrow 与mCCDA琼脂平板上，微需氧条件下42 ℃±1 ℃培养24 h～48 h。另外可选择使用空肠弯曲菌显色平板。

观察24 h培养与48 h培养的琼脂平板上的菌落形态，mCCDA琼脂平板上的可疑菌落通常有光泽、潮湿、扁平，呈扩散生长的倾向。Skirrow琼脂平板上的第一型可疑菌落为灰色、扁平、湿润有光泽，呈沿接种线向外扩散的倾向；第二型可疑菌落常呈分散凸起的单个菌落，边缘整齐、发亮。空肠弯曲菌显色培养基上的可疑菌落按照说明进行判定。

5.4 鉴定

5.4.1  弯曲菌属的鉴定

挑取5个或更多的可疑菌落接种到哥伦比亚琼脂平板上，微需氧条件下42 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，按照5.4.1.1～5.4.1.5进行鉴定，结果符合表1的可疑菌落确定为弯曲菌属。

 

表1 弯曲菌属的鉴定

 

5.4.1.1  形态观察                     

挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检。

5.4.1.2  动力观察

挑取可疑菌落用1 mL 布氏肉汤悬浮，用相差显微镜观察运动状态。

5.4.1.3  氧化酶试验

用铂/铱接种环或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在10 s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性。

5.4.1.4  微需氧条件下25 ℃±1 ℃生长试验

挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚琼脂平板上，微需氧条件下25 ℃±1 ℃培养44 h±4 h，观察细菌生长情况。

5.4.1.5  有氧条件下42 ℃±1 ℃生长试验

挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚琼脂平板上，有氧条件下42 ℃±1 ℃培养44 h±4 h，观察细菌生长情况。

5.4.2 空肠弯曲菌的鉴定

5.4.2.1  过氧化氢酶试验

挑取菌落，加到干净玻片上的3％过氧化氢溶液中，如果在30 s内出现气泡则判定结果为阳性。

5.4.2.2  马尿酸钠水解试验

挑取菌落，加到盛有0.4 mL 1％马尿酸钠的试管中制成菌悬液。混合均匀后在36 ℃±1 ℃水浴中温育2 h或36 ℃±1 ℃培养箱中温育4 h。沿着试管壁缓缓加入0.2 mL茚三酮溶液，不要振荡，在36 ℃±1 ℃的水浴或培养箱中再温育10 min后判读结果。若出现深紫色则为阳性；若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。

5.4.2.3  吲哚乙酸脂水解试验

挑取菌落至羟基吲哚醋酸盐纸片上，再滴加一滴灭菌水。如果吲哚乙酸脂水解，则在5 min～10 min内出现深蓝色；若无颜色变化则表示没有发生水解。

5.4.2.4  药物敏感性试验（可选择）

挑取菌落，在布氏肉汤中制备成浓度为0.5 McFarland的菌悬液，再用布氏肉汤制备1:10的稀释液，在Mueller Hinton琼脂平板上进行涂布，静置5 min后去除多余液体，将平板在36 ℃±1 ℃培养箱中放置10 min进行干燥。将头孢霉素（30 μg）和萘啶酮酸（30 μg）药敏纸片放在琼脂表面。将平板在微需氧条件下36 ℃±1 ℃培养22 h±2 h。如果细菌紧贴着纸片生长则为有抗性；如果纸片周围出现不同程度的细菌抑制生长则为敏感。空肠弯曲菌的鉴定结果见表2。

 

表2 空肠弯曲菌的鉴定

 

5.4.2.5  对于确定为弯曲菌属的菌落，可使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡进行鉴定。

5.5 结果报告

综合以上试验结果，报告检样单位中检出空肠弯曲菌或未检出空肠弯曲菌。

（规范性附录）

 

A.1.1 基础培养基

A.1.1.1 成分

A.1.1.2 制法

用水溶解基础培养基成分，如需要可使用加热促其溶解。将基础培养基分装至合适的锥形瓶内，121 ℃ 灭菌15 min。

A.1.2 无菌裂解脱纤维绵羊或马血

    对无菌脱纤维绵羊或马血通过反复冻融进行裂解或使用皂角苷进行裂解。

A.1.3 抗生素溶液

A.1.3.1 成分

A.1.3.2 制法

将上述成分溶解于乙醇/灭菌水混合溶液中。

A.1.4 完全培养基

A.1.4.1 成分

A.1.4.2 制法

当基础培养基的温度约为45 ℃左右时，无菌加入绵羊或马血和抗生素溶液，混匀，将完全培养基的pH值调至7.4±0.2（25 ℃），将培养基无菌分装至合适的试管或锥形瓶中备用。配制的增菌液在常温下放置不得超过4 h，或在4 ℃左右避光保存不得超过7 d。

 

A.2.1 基础培养基

A.2.1.1 成分

A.2.1.2 制法

用水溶解基础培养基成分，煮沸。分装至合适的三角瓶内，121 ℃ 高压灭菌15 min。

A.2.2 抗生素溶液

A.2.2.1 成分

A.2.2.2 制法

将上述成分溶解于乙醇/灭菌水混合溶液中。

A.2.3 完全培养基

A.2.3.1成分

A.2.3.2 制法

当基础培养基的温度约为45 ℃左右时，加入抗生素溶液，混匀。将完全培养基的pH值调至7.4±0.2（25 ℃）。倾注约15 mL于无菌平皿中，静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。可将平皿盖打开，使培养基面朝下，置于干燥箱中约30 min，直到琼脂表面干燥。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4 h，或在 4 ℃左右冷藏不得超过7 d。

 

A.3.1  基础培养基

A.3.1.1  成分

A.3.1.2 制法

将基础培养基成分溶解于水中，加热促其溶解。分装至合适的三角瓶内，121 ℃高压灭菌15 min。

A.3.2  无菌脱纤维绵羊血

    无菌操作条件下，将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中，振摇约10 min，静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。

A.3.3 完全培养基

A.3.3.1 组分

A.3.3.2 制法

当基础培养基的温度为45 ℃左右时，无菌加入绵羊血，混匀。将完全培养基的pH值调至7.3±0.2（25 ℃）。倾注15 mL 完全培养基于无菌平皿中，静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。可将平皿盖打开，使培养基面朝下，置于干燥箱中约30 min，直到琼脂表面干燥。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4 h，或在 4 ℃左右冷藏不得超过7 d。

 

A.4.1 成分

A.4.2  制法

将基础培养基成分溶解于水中，如需要可加热促其溶解。将高压灭菌后培养基的pH值调至7.0±0.2（25 ℃）。将培养基分装至合适的试管中，每管10 mL，121 ℃高压灭菌15 min。

 

A.5.1 成分

A.5.2  制法

使用前迅速将上述成分溶于水中。

 

A.6.1 马尿酸钠溶液

A.6.1.1 成分

A.6.1.2  制法

将马尿酸钠溶于磷酸盐缓冲溶液中，过滤除菌。用合适的试管进行无菌分装，每管0.4 mL，储存于-20 ℃。

A.6.2   3.5% (水合)茚三酮溶液 (质量/ 体积)

A.6.2.1  成分

A.6.2.2  制备

将（水合）茚三酮溶解于丙酮/丁醇混合液中。该溶液在避光冷藏时最多不超过7 d。

 

A.7.1  基础培养基

A.7.1.1  成分

A.7.1.2  制法

将基础培养基成分溶解于水中，煮沸。将基础培养基分装于合适的三角瓶中，121 ℃高压灭菌15 min。

A.7.2  无菌脱纤维绵羊血

    无菌操作条件下，将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中，振摇约10 min，静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。

A.7.3  完全培养基

A.7.3.1  成分

A.7.3.2 制法

当基础培养基的温度约为45 ℃左右时，无菌加入绵羊血，混匀。根据需要，将完全培养基的pH值调至7.2±0.2（25 ℃）。倾注约15 mL于灭菌平皿中，静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。可将平皿盖打开，使培养基面朝下，置于干燥箱中约30 min，直到琼脂表面没有可见潮湿。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4 h，或在 4℃左右冷藏不得超过7 d。

 

A.8  吲哚乙酸脂纸片（Indoxyl acetate disc）

A.8.1 成分

A.8.2 制法

将吲哚乙酸脂溶于丙酮中，吸取25 μL～50 μL溶液于空白纸片上（直径为0.6 cm～1.2 cm）。室温干燥，用带有硅胶塞的棕色试管/瓶于4 ℃保存。

 

A.9.1  基础培养基

A.9.1.1  成分

A.9.1.2  制法

将基础培养基成分溶解于水中，加热并搅拌促其溶解，121 ℃高压灭菌15 min。

A.9.2 FBP溶液

A.9.2.1 成分

A.9.2.2  制法

将各成分溶于100 mL水中，经0.22 μm 滤膜过滤除菌。FBP最好根据需要量现用现配，在－70 ℃储存不超过3个月或－20 ℃储存不超过1个月。

A.9.3 抗生素溶液

A.9.3.1 成分

A.9.3.2 制法

将上述成分溶解于乙醇/灭菌水混合溶液中。

A.9.4 无菌脱纤维绵羊血

无菌操作条件下，将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中，振摇约10 min，静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。

A.9.5 完全培养基

A.9.5.1成分

A.9.5.2 制法

当基础培养基的温度约为45 ℃左右时，加入FBP溶液、抗生素溶液与冻融的无菌脱纤维绵羊血，混匀。将完全培养基的pH值调至7.4±0.2（25℃）。倾注约15 mL于无菌平皿中，静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。可将平皿盖打开，使培养基面朝下，置于干燥箱中约30 min，直到琼脂表面没有可见潮湿。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4 h，或在4 ℃左右冷藏不得超过7 d。

 

A.10.1 成分

A.10.2 制法

    溶解蛋白胨于水中，将pH值调至7.0±0.2（25 ℃），121 ℃高压灭菌15 min。

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